1)以增强检测信号强度为出发点,结合电化学发光而开发的技术,如MSD。
2)以降低背景噪音为出发点,结合毛细管电泳而开发的技术,如Ella和Erenna等。
然而这些技术只能称为高灵敏,不能称为超灵敏,它们依然无法满足NfL、Tau等神经因子在外周血清中的检测,也无法在疾病初期近健康状态下检测IL-1β这些低丰度蛋白,应用范围仍然受到限制。
Simoa(Single-molecule Array)技术的出现,真正打破了僵局,其灵敏度比ELISA提高出1000倍以上,将蛋白质检测技术直接带入到单分子、数字化检测时代,成为fg级超低丰度蛋白质检测领域真正的王者。
Simoa是如何解决超低丰度蛋白检测问题的呢?
Simoa核心技术环节有两个:
1. 超低的反应体系,在提高灵敏度的同时,指数级降低背景噪音和信号扩散;
2. 数字化检测设计与定量方法,实现单分子信号的独立识别与计算,不放过任何一个检测信号。
Simoa检测的生物学原理仍然是经典的免疫反应-双抗夹心法,所不同的是,Simoa技术将约250,000个捕获抗体包被在2.7 μm的小磁珠上,检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物,通过一层油将单个磁珠分别封闭在238,000个4.5 μm的反应孔(Well)中进行反应。由于每个小孔的反应体系仅仅为50飞升,比传统ELISA小20亿倍,这时小孔中即使只有一个分子,其催化底物就可产生3000个荧光分子,通过CCD摄像头即可捕获到信号,利用泊松分布理论可计算出阳性荧光小孔(On Well)对应的蛋白浓度值,实现数字化单分子检测的愿望。
图1 Simoa与ELISA对比
1. Simoa可以在血清/血浆中检测NfL、Tau、pTau、Aβ40、Aβ42等超低丰度神经因子;
2. Simoa可以通过加大稀释倍数,检测房水、玻璃体、眼泪等微量样品中的炎症因子;
3. Simoa可以在单个细胞中定量蛋白,实现单个胚胎细胞培养上清中的蛋白检测;
4. Simoa可以在外泌体等稀少样品类型中检测PD1、PD-L1等蛋白;
5. Simoa可以在阿尔兹海默症初期(提前16年),在接近正常人的患者血清中检测到蛋白标志物NfL[2]。
相关文献:
1. Yeung D, et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg/mL levels of cytokines in human serum. JImmunolMethods. 2016 Oct; 437: 53-63.